Fluoreszenzspektroskopie

Photolumineszenz ist das Phänomen, dass ein Material Licht aussendet, nachdem es Licht absorbiert hat. Wenn die Lichtemission fast sofort (in Nanosekunden) erfolgt, spricht man von Fluoreszenz, wenn die Emission über einen längeren Zeitraum (Millisekunden) abklingt, von Phosphoreszenz. Ein Material, das Fluoreszenz zeigt, wird als Fluorophor bezeichnet, und solche Materialien werden in großem Umfang bei der Analyse von biologischem Material verwendet.

Dieses Whitepaper herunterladen

Fluorophore als Marker

Fluorophore werden in der Regel als Marker für bestimmte Molekülstrukturen oder Reaktionen verwendet. Wenn das Fluorophor an sein spezifisches Zielmolekül (wie eine Nukleinsäure) bindet, wird die Fluoreszenzeffizienz verstärkt, wie in Abbildung 1 dargestellt.

Figure 1: Illustration of how the fluorescence emission is enhanced when the fluorophore binds to its target molecule.

Warum optische Filter benötigt werden

Das Fluoreszenzsignal ist oft schwach und kann von einem viel stärkeren Hintergrundsignal überlagert werden, wie in Abbildung 2 dargestellt. Ein Photodetektor, wie ein Photomultiplier oder eine Siliziumphotodiode, erfasst die Gesamtintensität (die graue Fläche unter der Kurve) und daher kann es schwierig sein, zwischen kleinen Änderungen des Fluoreszenzsignals zu unterscheiden. Außerdem interessieren wir uns nur für die Intensitätsänderungen des Fluoreszenzmaximum (etwa 560 nm in Abbildung 2). Aus diesen Gründen werden in der Regel optische Filter verwendet, um einen möglichst großen Teil des Hintergrundlichts zu blockieren. Ein Beispiel mit einem Emissionsbandpassfilter ist in Abbildung 3 dargestellt. In den Beispielen in Abbildung 2 und Abbildung 3 stieg das Verhältnis zwischen der Fluoreszenzintensität und der gemessenen Gesamtintensität von etwa 8 % ohne Filter auf etwa 77 % mit Filter. Das bedeutet, dass mit dem Filter der Messwert des Fotodetektors viel näher am tatsächlichen Fluoreszenzsignal liegt als ohne Filter.

Figure 2: Example of weak fluorescence signal and strong back-ground signal.
Figure 3:Example of optical bandpass filter to limit the amount of back-ground signal outside the fluorescence emission peak.

Grundlagen der Fluoreszenz

Bei der Fluoreszenzspektroskopie interagiert das Licht (Photonen) mit den Elektronen in den Molekülen des Fluorophors. Um zu verstehen, was dabei geschieht, können wir uns das Jablonski-Diagramm in Abbildung 4 ansehen, das die elektronischen Zustände eines Moleküls darstellt. Das Molekül hat einen Grundzustand mit der niedrigsten Energie und einen angeregten Zustand mit höherer Energie. Innerhalb der einzelnen elektronischen Zustände kann sich das Molekül in verschiedenen Schwingungszuständen mit leicht unterschiedlicher Energie befinden, wie die dünnen Niveaus zeigen.

Figure 4: Jablonski diagram showing absorption and emission of light.

Licht kann als Photonen beschrieben werden, die jeweils eine Energie gleich hc/λ haben, wobei h die Plancksche Konstante, c die Lichtgeschwindigkeit und λ die Wellenlänge des Lichts ist. Die Photonenenergie ist also umgekehrt proportional zur Wellenlänge des Lichts. Wenn ein Photon mit einer Energie, die größer ist als die Differenz zwischen dem Grundzustand und dem angeregten Zustand, auf das Molekül trifft, kann das Photon absorbiert werden und das Molekül wird auf ein höheres Energieniveau angeregt. Durch Zusammenstöße zwischen den Molekülen geht ein kleiner Teil der Energie verloren, und das Molekül gelangt schnell in den niedrigsten angeregten Zustand. Aus diesem Zustand entspannt sich das Molekül zurück in den Grundzustand und sendet ein Photon mit einer Energie aus, die dem Energieunterschied zwischen den beiden Zuständen entspricht. Aus dieser Beschreibung lassen sich zwei wichtige Aspekte der Fluoreszenzspektroskopie ableiten:

  • Die Wellenlänge des emittierten Lichts ist immer länger als die Wellenlänge des absorbierten Lichts (weil die Photonenenergie umgekehrt proportional zur Wellenlänge ist und weil die emittierte Energie geringer ist als die absorbierte Energie).
  • Fluoreszenz ist ein fast augenblickliches Phänomen (weil die Relaxation aufgrund von Molekülzusammenstößen sehr schnell erfolgt).

Instrumentierung

Instrumente für die Fluoreszenzspektroskopie lassen sich im Allgemeinen in zwei Kategorien einteilen: Spektrofluorometer und Filterfluorometer. Erstere scannen das gesamte Spektrum und sind meist Allzweckgeräte, während Filterfluorometer die Emission bei einer oder wenigen diskreten Wellenlängen messen und meist für spezielle Anwendungen eingesetzt werden. Abbildung 5 zeigt die grundlegenden Komponenten eines einfachen Fluorometers. Das breitbandige Licht einer Lichtquelle wird durch einen Anregungsfilter geschickt, der die richtige Anregungswellenlänge für das Fluorophor auswählt. Das Fluorophor emittiert seinerseits Licht in alle Richtungen. Das Licht, das in einem Winkel von 90° zum Anregungslicht angeregt wird, wird durch einen Emissionsfilter geschickt, der die gewünschte Emissionswellenlänge auswählt. Schließlich wird das emittierte Licht von einem Photodetektor erfasst.

Figure 5: Simple 90 degrees angle fluorometer set-up using a broadband light source, an excitation filter, a cuvette with a fluorophore, an emission filter and a detector.

Die Anordnung im 90°-Winkel in Abbildung 5 ist vorteilhaft, weil sie verhindert, dass das starke Licht der Lichtquelle direkt auf den Detektor trifft. Auf diese Weise kann das schwache Fluoreszenzsignal besser erfasst werden. Bei einem Spektrofluorometer werden entweder beide oder einer der Filter in Abbildung 5 durch scannende Monochromatoren ersetzt, die so eingestellt werden können, dass jede Wellenlänge ausgewählt werden kann. Der Anregungsfilter wird auch als Primärfilter und der Emissionsfilter als Sekundärfilter oder Sperrfilter bezeichnet.

Bei bestimmten Anwendungen – z. B. bei Mikroplattenlesern – muss das Emissionslicht in einem Winkel von 180° statt 90° relativ zum Anregungslicht gemessen werden. Für solche Anwendungen wird in der Regel ein Aufbau wie in Abbildung 6 gezeigt verwendet. Ein dichroitischer Strahlenteiler wird in einem Winkel von 45° zum Anregungslicht eingesetzt. Der dichroitische Strahlenteiler reflektiert Licht mit der Anregungswellenlänge und überträgt Licht mit der Emissionswellenlänge.

Figure 6: Fluorometer set-up for reflective sample using a dichroic beamsplitter to separate the excitation from the emission light.

Laden Sie dieses Whitepaper herunter

Nutzen Sie diese Gelegenheit, um Ihr Wissen zu erweitern und Ihre Forschung zu beschleunigen.

Laden Sie dieses aktuelle Whitepaper zur Fluoreszenzspektroskopie herunter

Laden Sie dieses Whitepaper herunter

Filtertypen

Es gibt im Allgemeinen drei Arten von Filtern, die für Fluorometer verwendet werden:

In diesem Abschnitt werden wir diese Filter genauer beschreiben.

Kantenfilter

Kantenfilter gibt es in zwei Ausführungen – Langwellenpass (LWP) und Kurzwellenpass (siehe Abbildung 7). Die wichtigsten Parameter für einen Kantenfilter sind:

  • Die Wellenlänge der Flanke
  • Die Transmission im Durchlassbereich
  • Die Dämpfung im Sperrbereich
  • Die Steilheit der Flanke
  • Durchlassbereich
  • Sperrbereich
Figure 7: Long Wave Pass (LWP) and Short Wave Pass (SWP) edge filters

Siehe auch Abbildung 8 zur Definition der Schlüsselparameter. Die Blockierung lässt sich am besten auf einer logarithmischen Skala wie dem unteren Diagramm in Abbildung 8 darstellen. Die Transmission kann oft mehr als 90 % und die Sperrung außerhalb des Bandes mehr als sechs Größenordnungen (OD6) betragen. SWP-Kantenfilter können als Anregungsfilter und LWP-Kantenfilter als Emissionsfilter in Fluorometern verwendet werden. In der Regel wird für ein einzelnes Fluorophor ein Satz von SWP und LWP mit annähernd derselben Kantenwellenlänge verwendet. Der breite Durchlassbereich der Kantenfilter kann unerwünschtes Umgebungslicht außerhalb der Absorptions- und Emissionsbanden des Fluorophors auffangen; in diesem Fall ist ein Bandpassfilter die bessere Lösung. Auch wenn mehrere Emissionsbanden gemessen werden sollen (d. h. wenn mehrere Fluorophore verwendet werden), kann es vorteilhafter sein, Bandpassfilter anstelle von Kantenfiltern zu verwenden, wie im nächsten Abschnitt erläutert.

Figure 8: Definition of key parameters for an edge filter

Bandpassfilter

Wie der Name schon sagt, lässt ein Bandpassfilter Licht in einem bestimmten Wellenlängenbereich passieren und weist Licht außerhalb dieses Bereichs zurück, wie in Abbildung 9 dargestellt. Die wichtigsten Parameter für einen Bandpassfilter sind:

  • Die mittlere Wellenlänge
  • Das Durchlassband
  • Die Durchlässigkeit im Durchlassband
  • Die Dämpfung in den Sperrbereichen
  • Die Steilheit der Flanken

Ein modernes dielektrisches Bandpassfilter kann eine Transmission von mehr als 90 % im Durchlassband und eine Unterdrückung von mehr als OD6 in den Sperrbereichen erreichen. In einem Fluorometer kann anstelle von Kantenfiltern ein Satz von Bandpassfiltern verwendet werden. In diesem Fall liegt die zentrale Wellenlänge eines Bandpassfilters bei der Absorptionsspitze des Fluorophors und die des anderen Bandpassfilters bei der Emissionsspitze des Fluorophors. Bei einigen Anwendungen (wie dem Förster-Resonanz-Energie-Transfer – FRET) müssen zwei Emissionsspitzen gemessen werden. Daher ist es von Vorteil, zwei Bandpassfilter zu verwenden, die auf jeden der beiden Emissionspeaks zentriert sind.

Figure 9: Band pass filter

Dichroitische Elemente

Wie bereits erwähnt, verwenden einige Fluorometer einen dichroitischen Strahlenteiler, um das Anregungslicht vom Emissionslicht zu trennen. Ein dichroitischer Filter ist ein spezieller LWP-Kantenfilter, der für einen Einfallswinkel von 45° (AOI) optimiert ist. Der dichroitische Filter nutzt die grundlegende Eigenschaft eines dielektrischen Filters, dass Wellenlängen, die nicht durchgelassen werden, reflektiert werden. Siehe Abbildung 10 für eine Veranschaulichung dieser Funktionsweise. Da die Fluoreszenzemission viel schwächer ist als das Anregungslicht, ist es wichtig, dass die Transmission des LWP-Filters so hoch wie möglich ist. Dichroitische Filter bieten in der Regel eine Durchlässigkeit von mehr als 90 %. Die Blockierung des durchgelassenen Anregungslichts beträgt in der Regel zwei bis drei Größenordnungen (OD2-OD3).

Figure 10: Transmission and reflection in dichroic beamsplitter

Filterwürfel

Dichroitische Filter werden in der Regel zusammen mit einem Paar von Anregungs- und Emissionsfiltern verwendet, wie in Abbildung 6 skizziert. Um dem Benutzer den Zusammenbau und die Ausrichtung zu erleichtern, werden diese drei Filter in der Regel zu einem Filterwürfel kombiniert, wie in Abbildung 11 dargestellt.

Figure 11: Filter cube for fluorometer

Entwicklung der Fluoreszenzfilter

Optische Filter für die Fluoreszenzspektroskopie wurden ursprünglich aus farbigem Glas oder Polymeren hergestellt. Heute werden jedoch in der Regel fortschrittlichere Interferenzfilter verwendet, da sie genau auf die Anforderungen der Absorptions- und Emissionsspektren eines bestimmten Fluorophors abgestimmt werden können.

Farbfilter

Farbfilter bestehen in der Regel aus einem Farbstoff, der in ein Substratmaterial eingearbeitet ist. Diese Filter funktionieren, indem sie Teile des Spektrums absorbieren und andere durchlassen. So lässt beispielsweise ein grünes Glas Wellenlängen um 550 nm durch, während es Wellenlängen im blauen und roten Bereich absorbiert. Die Absorption und Transmission hängt von der Dicke des Filters ab. Der Hauptvorteil eines Farbfilters besteht darin, dass er das unerwünschte Licht absorbiert, was bedeutet, dass bei der Konstruktion des Fluorometers kein Streulicht zu berücksichtigen ist. Farbfilter haben jedoch mehrere Nachteile. Zunächst einmal sind die nutzbaren zentralen Wellenlängen und Bandbreiten durch die verfügbaren Farbstoffe begrenzt. Außerdem ist die Flankensteilheit oft recht gering. Bestimmte Farbfilter sind auch feuchtigkeits- und temperaturempfindlich und müssen daher meist mit einer Schutzschicht versehen werden.

Interferenzfilter

In den 1960er Jahren wurden Interferenzfilter als Alternative zu Farbfiltern verfügbar. Interferenzfilter werden hergestellt, indem dünne Schichten dielektrischer Materialien mit unterschiedlichem Brechungsindex und unterschiedlicher Dicke auf ein Glassubstrat aufgebracht werden. Wie der Name schon sagt, funktioniert ein Interferenzfilter so, dass Wellenlängen mit konstruktiver Interferenz im dielektrischen Stapel durchgelassen werden, während die übrigen Wellenlängen reflektiert werden. Abbildung 12 zeigt eine Skizze der Funktionsweise eines Interferenzfilters.

Figure 12: Illustration of how an interference filter functions by transmitting wavelengths that experience constructive interference in the dielectric layers and reflecting all other wavelengths.

Der Hauptvorteil von Interferenzfiltern gegenüber Farbfiltern besteht darin, dass Interferenzfilter genau so entworfen und hergestellt werden können, wie es für eine bestimmte Anwendung erforderlich ist. Auch die Leistung von Interferenzfiltern, z. B. in Bezug auf die Flankensteilheit, übertrifft normalerweise die von Farbfiltern. Das Schott OG515 LWP-Filter ist beispielsweise ein Farbfilter mit einer Flanke bei 515 nm und einem Übergang von 10 % auf 90 % Transmission über 31 nm (von 503 – 534 nm), während das Delta Optical Thin Film Interferenzfilter LF101594 ebenfalls eine Flanke bei 515 nm hat, aber einen Übergang von 10 % auf 90 % über nur 5 nm (von 512 – 517 nm). Die ersten Interferenzfilter wurden durch ionenunterstützte Abscheidung hergestellt, was ein langsamer Prozess war und außerdem zu so genannten „weichen Beschichtungen“ führte, die nicht sehr haltbar waren und versiegelt werden mussten. Später wurde das Ionenstrahl-Sputtern eingeführt, das „harte Beschichtungen“ erzeugte, die haltbar waren. Leider ist dieses Verfahren sehr langsam, was zu hohen Kosten führt und die Anzahl der Schichten, die praktisch aufgebracht werden können, begrenzt. Das Magnetron-Sputtern ist eine neue Technik, die von Delta Optical Thin Film eingesetzt wird und sowohl hohe Abscheidungsraten als auch harte, dauerhafte Schichten ermöglicht. Dieses Verfahren eignet sich sehr gut für die kosteneffiziente Herstellung von Hochleistungsfiltern für Fluorometer für POC in hohen Stückzahlen.

Fluorometer für den Point-of-Care-Bereich

Point-of-Care-Instrumente (PoC-Instrumente) sind eine besondere Art von medizinischen Geräten, die für die Diagnostik am Krankenbett, in der Klinik oder sogar zu Hause bestimmt sind. Solche Geräte zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass sie kompakt, kosteneffizient und einfach zu bedienen sind. Viele PoC-Instrumente messen typischerweise chemische Reaktionen biologischer Proben, und die Fluoreszenz ist eine der dafür verwendeten Methoden. Als Beispiel werden wir beschreiben, wie ein PoC-Fluorometer für den schnellen Nachweis von Covid-19 aufgebaut werden kann.

Figure 13: Extraction and staining of viral COVID-19 RNA

Die gebräuchlichste Nachweismethode für COVID-19 ist die Nukleinsäureamplifikation, bei der die viralen RNA-Stränge z. B. aus Speichel extrahiert und zu viralen DNA-Strängen amplifiziert werden. Diese Stränge werden dann mit einem Fluorophor angefärbt, das nur an die virale RNA bindet. Auf diese Weise wird das Vorhandensein von Fluoreszenzemissionen zu einem direkten Indikator für das Virus. Ein Beispiel für ein Fluorophor, das sich für den COVID-19-Nachweis eignet, ist das von ThermoFisher vertriebene SYBR Green, das eine Spitzenabsorption bei 498 nm und eine Spitzenemission bei 522 nm aufweist, wie in Abbildung 14 dargestellt.

Figure 14: Excitation and emission spectra of SYBR Green.

Wie bereits erwähnt, muss ein PoC-Instrument kompakt und kosteneffizient sein, weshalb häufig die 90°-Konfiguration gewählt wird. Wie in Abbildung 15 dargestellt, ist es letztendlich möglich, ein Instrument mit einer LED für die Anregung sowie einem Anregungs- und einem Emissionsfilter zu bauen. LEDs sind energieeffizient und kostengünstig und haben darüber hinaus den Vorteil, dass sie eine begrenzte Anregungsbandbreite haben – typischerweise etwa 20 nm bis 30 nm FWHM. Das bedeutet, dass die LED nur sehr wenig außerhalb der Anregungsbande des Fluorophors emittiert.

Figure 15: Simple fluorescence excitation and emission scheme for POC instrument.

Darüber hinaus können moderne Bandpassfilter, wie die von Delta Optical Thin film hergestellten, eine sehr hohe Transmission im Emissionsband (mehr als 95 %) und eine sehr tiefe Blockierung (mehr als OD6) im Anregungsband bieten. Abbildung 16 zeigt am Beispiel von SYBR Green, wie ein Bandpassfilter bei 545 nm mit einer Bandbreite von 30 nm einen großen Teil der Emission durchlässt und die Anregung effektiv blockiert. Schließlich können die Kosten und die Größe des Geräts durch die Verwendung möglichst kleiner optischer Filter reduziert werden. Delta Optical Thin Film stellt routinemäßig Fluoreszenzfilter bis hinunter zu einigen mm x mm in großen Mengen für PoC-Geräte her.

Figure 16: Filtering of the emission and excitation spectra of SUBR Green with a bandpass filter with center wavelength 545 nm and a bandpass of 30 nm.

Bleiben Sie auf dem Laufenden mit unserem Expertenwissen

Erhalten Sie die neuesten Nachrichten und Erkenntnisse über optische Filter – abonnieren Sie unseren Newsletter.

Erhalten Sie unsere wertvollen Einblicke