Erkunden Sie die vielen Arten von optischen Filtern, die in der Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden.
Fluoreszenzfilter
Fluoreszenzfilter sind wesentliche Bestandteile von Fluoreszenzmikroskopen, Spektralphotometern, Mikroplattenlesern und Durchflusszytometern. Es gibt eine Vielzahl von Filtertypen, was die Auswahl der am besten geeigneten Filter für eine bestimmte Anwendung schwierig macht. Insgesamt wird die Wahl der Filter für Ihr Fluoreszenzinstrument durch die Absorptions- und Emissionsspektren des verwendeten Fluorophors bestimmt. Aber selbst wenn die Fluorophore bekannt sind, gibt es immer noch eine Vielzahl von grundlegend unterschiedlichen Filtertypen, aus denen Sie wählen können. Auf dieser Seite finden Sie eine kurze Beschreibung der gebräuchlichsten Filtertypen, die in fluoreszenzbasierten Instrumenten verwendet werden.
Wichtige Funktionen von Fluoreszenzfiltern
Fluoreszenzfilter können aufgrund ihrer Funktion in drei grundlegende Kategorien eingeteilt werden:
- Anregungsfilter
- Dichroitische Filter
- Emissionsfilter
Die Filter werden in der Regel in der in der Abbildung gezeigten Konfiguration verwendet. Der Anregungsfilter wählt die geeignete Wellenlänge der Lichtquelle aus, um das Fluorophor in der Probe anzuregen. Der dichroitische Spiegel lenkt das Anregungslicht auf die Probe und leitet die emittierte Fluoreszenz zum Detektor. Der Emissionsfilter schließlich wählt die Wellenlänge des Emissionsmaximums des Fluorophors in der Probe aus und blockiert gleichzeitig das Anregungslicht.
Anregungsfilter
Ein Anregungsfilter ist ein optischer Filter, der in der Fluoreszenzmikroskopie und anderen auf der Fluoreszenzspektroskopie basierenden Techniken verwendet wird, um die Wellenlänge des Lichts auszuwählen, das zur Anregung eines Fluorophors verwendet wird. Andere Bezeichnungen für einen Anregungsfilter sind Primärfilter oder Exzitationsfilter. Der Anregungsfilter stellt sicher, dass nur die geeigneten Wellenlängen des Lichts zur Anregung der Fluorophore verwendet werden, was dazu beiträgt, hochwertige und spezifische Fluoreszenzsignale von der Probe zu erhalten. Ein Anregungsfilter kann in vier grundlegend verschiedene Arten von Filtern unterteilt werden, die im Folgenden beschrieben werden.
Anregungs-Kantenfilter
Da die Anregungswellenlänge bei Fluorophoren immer kürzer ist als die Emissionswellenlänge, kann ein Kurzpassfilter als Anregungsfilter verwendet werden. Der Kantenfilter lässt Wellenlängen durch, die kürzer als die Kantenwellenlänge sind, und blockiert Wellenlängen, die länger als die Kantenwellenlänge sind. Je steiler die Flanke des Filters ist, desto besser trennt er die Anregung von der Emission.
Anregungs-Bandpassfilter
Der gebräuchlichste Typ von Anregungsfiltern ist ein Bandpassfilter, dessen mittlere Wellenlänge mit der Wellenlänge des Absorptionsmaximums des verwendeten Fluorophors übereinstimmt. Im Vergleich zum Kantenfilter blockiert der Bandpassfilter Wellenlängen außerhalb der Absorptionsbande des Fluorophors. Dadurch wird die Menge des unerwünschten Hintergrundlichts reduziert und der Kontrast verbessert.
Anregungs-Multibandpassfilter
Bei fortschrittlicheren Fluoreszenzanwendungen können mehrere Fluorophore gleichzeitig in der sogenannten Mutiplex-Fluoreszenz eingesetzt werden. In diesem Fall kann die Lichtquelle eine Anordnung von Leuchtdioden sein, die jeweils mit einer Zentralwellenlänge ausgewählt werden, die mit einem der Absorptionspeaks des Fluorophors übereinstimmt. Durch die Verwendung eines Multibandpassfilters als Anregungsfilter ist es möglich, ein kompaktes, einfaches und robustes Fluoreszenzinstrument zu bauen, das Multiplex-Fluoreszenzanwendungen unterstützt.
Durchstimmbare Anregungsfilter
Die vielseitigsten Instrumente ermöglichen es dem Benutzer, die Anregungswellenlänge auf jeden Fluorophor abzustimmen. Dies wird in der Regel mit rotierenden Gittermonochromatoren realisiert. Die gleiche Funktion kann jedoch auch mit einem Satz verschiebbarer, kontinuierlich variabler Filter effizient umgesetzt werden. Durch die Kombination eines unserer kontinuierlich variablen Kurzwellenpassfilter (CVSWP) mit einem kontinuierlich variablen Langwellenpassfilter (CVLWP) kann ein durchstimmbarer Bandpassfilter implementiert werden, bei dem sowohl die zentrale Wellenlänge als auch die Bandbreite durchstimmbar sind. Sehen Sie sich ein Video an, um zu erfahren, wie dies funktioniert.
Dichroitische Strahlenteiler
Wie bereits erwähnt, verwenden einige Fluorometer einen dichroitischen Strahlenteiler, um das Anregungslicht vom Emissionslicht zu trennen. Ein dichroitischer Filter ist ein spezieller LWP-Kantenfilter, der für einen Einfallswinkel von 45° (AOI) optimiert ist. Der dichroitische Filter nutzt die grundlegende Eigenschaft eines dielektrischen Filters, dass Wellenlängen, die nicht durchgelassen werden, reflektiert werden. Da die Fluoreszenzemission viel schwächer ist als das Anregungslicht, ist es wichtig, dass die Transmission des LWP-Filters so hoch wie möglich ist. Dichroitische Filter bieten in der Regel eine Transmission von mehr als 90 %. Die Blockierung des durchgelassenen Anregungslichts beträgt in der Regel zwei bis drei Größenordnungen (OD2-OD3). Bei fortgeschrittenen Fluoreszenzaufbauten, bei denen die Anregungs- und Emissionsbanden variabel sein müssen, kann es erforderlich sein, dass die Kantenwellenlänge des dichroitischen Filters abstimmbar ist. Dies kann mit einem kontinuierlich variablen Strahlenteiler erreicht werden.
Emissionsfilter
Ein Emissionsfilter ist ein optischer Filter, der in der Fluoreszenzmikroskopie und anderen auf der Fluoreszenzspektroskopie basierenden Techniken verwendet wird, um die Wellenlänge des Lichts auszuwählen, das von einem Fluorophor emittiert wird. Andere Bezeichnungen für einen Emissionsfilter sind Sekundärfilter oder Sperrfilter. Der Emissionsfilter stellt sicher, dass nur die geeigneten Wellenlängen des vom Fluorophor emittierten Lichts auf den Detektor treffen, was dazu beiträgt, hochwertige und spezifische Fluoreszenzsignale von der Probe zu erhalten. Ein Emissionsfilter kann in Form von vier grundlegend verschiedenen Filtertypen eingesetzt werden, die im Folgenden beschrieben werden.
Emissions-Kantenfilter
Da die Emissionswellenlänge bei Fluorophoren immer länger ist als die Anregungswellenlänge, kann ein Langpasskantenfilter als Emissionsfilter verwendet werden. Der Kantenfilter lässt Wellenlängen durch, die länger als die Kantenwellenlänge sind, und blockiert Wellenlängen, die kürzer als die Kantenwellenlänge sind. Je steiler die Flanke des Filters ist, desto besser trennt er die Anregung von der Emission.
Emissions-Bandpassfilter
Der gebräuchlichste Typ von Emissionsfiltern ist ein Bandpassfilter, dessen Zentralwellenlänge der Wellenlänge des Fluorophors entspricht, die die höchste Fluoreszenz aufweist. Im Vergleich zum Kantenfilter blockiert der Bandpassfilter Wellenlängen außerhalb der Absorptionsbande des Fluorophors. Dadurch wird die Menge des unerwünschten Hintergrundlichts reduziert und der Kontrast verbessert.
Emissions-Multibandpassfilter
Bei fortgeschritteneren Fluoreszenzanwendungen können mehrere Fluorophore gleichzeitig in der so genannten Mutiplex-Fluoreszenz eingesetzt werden. In diesem Fall werden die Fluorophore so ausgewählt, dass sie bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, um eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Molekülgruppen zu ermöglichen. Mit der Verwendung eines Multibandpassfilters als Emissionsfilter ist es möglich, ein kompaktes, einfaches und robustes Fluoreszenzinstrument zu bauen, das Multiplex-Fluoreszenzanwendungen unterstützt.
Durchstimmbare Emissionsfilter
Die vielseitigsten Geräte ermöglichen es dem Benutzer, die Emissionswellenlänge auf jeden Fluorophor abzustimmen. Dies wird in der Regel mit rotierenden Gittermonochromatoren realisiert. Die gleiche Funktion kann jedoch auch mit einem Satz verschiebbarer, kontinuierlich variabler Filter effizient umgesetzt werden. Durch die Kombination eines unserer kontinuierlich variablen Kurzwellenpassfilter (CVSWP) mit einem kontinuierlich variablen Langwellenpassfilter (CVLWP) kann ein durchstimmbarer Bandpassfilter implementiert werden, bei dem sowohl die zentrale Wellenlänge als auch die Bandbreite durchstimmbar sind. Sehen Sie sich ein Video an, um zu erfahren, wie dies funktioniert.
GFP- und DAPI-Anregungs- und Emissionsfilter
Zu den am häufigsten verwendeten Fluorophoren gehören das grün fluoreszierende Protein (GFP) und 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI). Ein Satz von Fluoreszenzfiltern kann daher als GFP-Anregungs- und Emissionsfilter oder als DAPI-Anregungs- und Emissionsfilter bezeichnet werden. Dies bezieht sich oft auf einen Satz von zwei Bandpassfiltern und einen dichroitischen Spiegel, die für die Absorptions- und Emissionsspitzen von GFP bzw. DAPI optimiert sind. In vielen Experimenten ist es jedoch üblich, das Fluorophor so zu modifizieren, dass es an eine bestimmte Zielmolekülgruppe binden kann. Diese Modifikation kann die Absorptions- und Emissionsspektren des Fluorophors verändern, so dass es immer ratsam ist, diese Spektren vor der Bestellung eines Filtersets zu überprüfen.
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